биотехнология для чайников фитокамера для растительных культур, фотография любезно предоставлена Н.В. Пликиной
биотехнология составы и приготовление питательных сред культивирование клеток тесты по биотехнологии

Последовательность приготовления питательных сред для растительных клеток

Составление питательной среды начинают с приготовления концентрированных (маточных) растворов.
Почему готовят маточные растворы, а не отвешивают соли для приготовления 1 среды? Для удобства - чтобы не взвешивать все необходимые соли всякий раз, когда вздумается завести культуру. С другой стороны, концентрированные растворы менее подвержены опасности быть съеденными микроорганизмами, которая существует даже при хранении разбавленных растворов в холодильнике. Ведь соленые огурцы у вас хранятся гораздо дольше, чем свежие.
Вторая причина, по которой мы готовим маточные растворы - снижение погрешности при отмеривании необходимого количества солей. Согласитесь, взвесить 5 граммов проще, чем 50 миллиграмов - во всяком случае мерную емкость, которой потом можно будет отмерить 5, 10 или 20 миллилитров найти проще, чем аналитические весы.
Обычно готовят несколько маточных растворов - макроэлементы, хелатное железо, микроэлементы, хлористый кальций, витамины, хранят их в отдельных колбах, а при приготовлении среды сливают в той последовательности, в какой они перечислены выше. Делается это для того, чтобы при взаимодействии солей не происходило образование осадка.
Макросоли взвешивают на технических весах, растворяют по отдельности в небольшом количестве бидистиллята и доводят в цилиндре до объема, в 10 меньшего, чем требуется по прописи среды, т.е. на 1 литр общего объема питательной среды берут 100 мл раствора макросолей. Иногда эта пропорция изменяется, и концентрация увеличивается не в 10 раз, а более, соответственно меняется и объем маточного раствора, который берется для приготовления 1 литра питательной среды.
Например, если мы готовим 1 литр (1000 мл) маточного раствора, увеличивая концентрацию солей в нем в 20 раз (масса навески каждой соли * 20), то для приготовления среды берется 50 мл такого концентрированного раствора (как в случае среды Мурасиге-Скуга). Таким образом, в этим 1 литре маточного раствора у нас 20 порций по 50 мл для приготовления 20 сред (20*50=1000). Если концентрация увеличивается в 25 раз, то берется 40 мл и т.д.
Навески микросолей для хелатного железа растворяют по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концентрацией 50 мл/л. Раствор должен получится ярко-желтого цвета, рН 8.0. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция или магния.
Навески микроэлементов взвешивают на аналитических весах, растворяют так, чтобы конечная концентрация соответствовала 5 мл раствора на 1 литр готовой среды, то есть для приготовления питательной среды мы будем брать по 5 миллилитров.
Полученные растворы сливают в склянки с притертыми крышками, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Железо-хелатный комплекс хранят в темной склянке.
Витамины готовить несколько сложнее.
Обычный "чайник" имеет в своем распоряжении витамины в виде растворов - из аптеки, в капсулах. Самая большая проблема - правильно определить, сколько же граммов или миллиграммов искомого вещества может содержать капсула с витамином. Обычно на коробочке пишут 1%, 5%, 6% раствор тиамин-хлорида,  никотиновой кислоты или другого необходимого вам витамина. Это означает, что для его приготовления 1% раствора было взято 1000 миллиграмм вещества, которые растворили в 100 мл воды. Следовательно, каждый миллилитр этого раствора содержит 10 миллиграмов витамина. Стандартная аптечная расфасовка - капсулы по 1 миллилитру. Значит, в каждой капсуле содержится 10 миллиграммов витамина, если это 1% раствор, 50 мг - если 5%. Если вам требуется 10 миллиграммов  определенного витамина, а вы имеете в распоряжении капсулу объемом 1 мл, содержащую 50 мг вещества, то что вы сделаете? Правильно - добавите содержимое этой капсулы в мерный цилиндр, доведете объем до 50 мл (лучше всего вытянуть раствор из капсулы шприцем и потом несколько раз промыть дистиллятом и шприц, и капсулу, сливая воду в цилиндр, где вы производите разбавление. И уже разведенного раствора вы возьмете 10 миллилитров.
Витамины разливают по 5 мл в пенициллиновые флакончики  или пробирки, ставят в морозилку и  хранят в замороженном виде. Концентрированные растворы готовят с расчетом добавления 5 мл на 1 литр среды. При составлении среды флакончик с витаминами достают из холодильника, размораживают, опуская в горячую воду, и выливают в колбу с питательной средой.
Фитогормоны (ауксины и цитокинины) сначала растворяют в 2 мл 96oC этилового спирта (или 0.1 н NaCl) и добавляют 98 мл воды, доводя объем до 100 мл, хранят при температуре 2-4оС. Гиббереллин легко растворим в воде.

Последовательность приготовления питательной среды

Необходимую навеску агар-агара растворяют 300 мл дистиллированной воды (можно при подогревании), добавляют сухие органические компоненты, перемешивают.
С помощью мерного цилиндра и пипеток отбирают маточные растворы макросолей, микроэлементов, хелатного железа, гормонов, витаминов и переносят их в колбу на 1 литр с уже растворенным агаром, доводят рН до необходимого значения с помощью 0.1 н NaOH или HCl.
Доводят объем готовой среды до литра . Среду варят на водяной бане при постоянном помешивании минут 20 до полного растворения агара. Готовую среду разливают в горячем виде по пробиркам или колбам.
Колбы или пробирки закрывают ватными пробками, накрывают целлофаном и затягивают резинкой. Можно закрывать плотной фольгой вместо пробок. Если нет целлофана, то перед автоклавированием пробирки или колбы закрываются сверху крафтовой бумагой.
Автоклавированную среду, содержащую ауксины, лучше использовать сразу; если среду необходимо хранить продолжительное время, её помещают в холодильник при 2-4оС.
Некоторые фитогормоны, например гибберелловую кислоту и зеатин, а также аминокислоты автоклавировать нельзя по причине их термолабильности. В таких случаях среду готовят без этих веществ, автоклавируют, охлаждают до 50оС, в стерильных условиях добавляют термолабильный компонент, пропущенный через бактерицидный фильтр с размером пор 0.22 мкм, разливают по пробиркам и колбам.



отправить письмо © Н.А. Кузьмина 2006-2009