культивирование фибробластов человека

Культивирование фибробластов человека

Культуральная посуда и оборудование: пипетки мерные от 1 до 10 мл, пипетки Пастера, пенициллиновые флаконы, пробирки Лейтона, мерные флаконы от среды разных объемов, пробки резиновые N 10, 12.5, 14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно нарезанные для помещения их в пенициллиновые флаконы, пинцеты глазные анатомические и хирургические, зажим Кохера, бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей стали, резиновая груша для работы с пипетками (с надетой резиновой трубкой), инвертированный микроскоп, ламинар-бокс, термостат.

Питательная среда для культивирования фибробластов:

Фибробласты успешно культивируют на разных средах, но рекомендуется использовать следующий состав питательной среды - среда Игла - 90-85%, сыворотка крупного рогатого скота - 5-10%, пуповинная сыворотка человека (фетальная сыворотка) - 5%, глютамин - 150 мг на 500 мл готовой среды. Готовую среду и её компоненты рекомендуется хранить при 4^оС.
Пуповинную сыворотку (если нет готовой) можно приготовить следующим образом: собрать кровь в родильном отделении (стерильные флаконы подставляют под отрезанный конец пуповины до рождения плаценты), хранить в холодильнике до образования сгустка. После этого сыворотку сливают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 500 g 2 раза по 20 мин, осветляют путем фильтрации через мембранные фильтры последовательно диа-метром пор 0.85, 0.4, 0.3, 0.22 мкм, последняя фильтрация - стерилизующая, и проводится в стерильных условиях. Стерильность полученной сыворотки проверяют посевом на агар. При культивировании эксплантов рекомендуется использовать антибиотики (40-60 мкг канамицина на 1 литр среды).

Ход работы:

1. Взятие биопсии. Фибробласты можно получать из многих тканей и органов. Проще всего - фибробласты дермального слоя кожи. Наиболее удобно брать биопсию со внутренней стороны предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфицируют 70% этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять другие дезинфицирующие растворы, так как в случае проникновения в биопат они могут оказать токсическое действие. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают и отрезают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета. Не следует стремиться взять глубокие слои кожи. При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой кожи, кровотечение минимально. Отсечение лучше проводить лезвием безопасной бритвы, простерилизованной (как и пинцет) путем погружения в этиловый спирт с последующим поджиганием. Отсеченный кусочек погружается в заранее приготовленный пенициллиновый флакон со средой. На рану накладывают бактерицидный пластырь. Фрагмент кожи может храниться в питательной среде при 4^оС в течение 3-4 суток без утраты фибробластами способности к росту.

2. Получение экспланта. В стерильную чашку Петри с каплей 0.25% раствора трипсина или питательной среды помещают фрагмент кожи. Придерживая пинцетом, нарезают на мелкие кусочки величиной с булавочную головку и меньше стерильным лезвием безопасной бритвы, зажатой в зажим Кохера или Пеана. При помощи изогнутой препаровальной иглы кусочки извлекают из капли и помещают на покровное стекло, находящееся в пенициллиновом флаконе или пробирке Лейтона. Уложенные кусочки накрывают другим покровным стеклом, слегка прижимая препаровальной иглой. Наливают в культуральный сосуд питательную среду так, чтобы она покрыла верхнее стекло. Покровные стекла с зажатыми между ними кусочками кожи при помощи пинцета кладут на боковую стенку пенициллинового флакона. Флаконы плотно закрывают пробкой и устанавливают на подставке под углом примерно в 30^о. Культуры инкубируют в термостате при 37^оС. В течение недели следят за цветом среды. Изменение цвета индикатора к желто-оранжевому свидетельствует о хорошем состоянии экспланта.
Через неделю ежедневно начинают просматривать культуру под микроскопом. Можно использовать как инвертированный, так и обычный микроскоп. В последнем случае следует осторожно повернуть флакон, при этом стекла с культурой прилипают к боковой стенке флакона и могут быть исследованы при малом увеличении. Вокруг кусочков вначале появляются единичные фибробласты, которые заметны в виде длинных веретеновидных клеток, либо появляется слой эпителия, окружающий фрагмент в виде “кружевного” ореола. При появлении зоны выроста клеток следует сменить среду. Когда клетки займут все пространство между кусочками (это видно невооруженным глазом или при помощи лупы), их пересевают.

Культивирование фибробластов человека

Разделы сайта: